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冷榨法和水酶法提取对山核桃油活性成分的影响

发布日期:2022-04-06 17:36来源:中国油脂作者:李晴(lkmoo上传)点击次数:

  山核桃(Carya cathayensis Sarg.)又称小核桃、山哈,系胡桃科山核桃属木本油料作物\[1\]。山核桃主产于浙皖交界的昌化山区,其中安徽省宁国市和浙江省杭州市临安区是主要种植区,其产量接近全国的90%\[2\]。山核桃仁含油量高达53%~69%,其油脂含多酚、黄酮、维生素E、角鲨烯、β-谷甾醇等多种活性成分,因此山核桃长期以来备受大众欢迎。 近年来对山核桃油的研究多着眼于营养成分、品质控制技术及功能性开发等方面,而不同提取方法对山核桃油活性成分影响各异\[3\],如何选择可以更好地保留其中活性成分的油脂提取方法就显得尤为重要。植物油的提取方法有压榨法、超临界CO2萃取法、有机溶剂浸出法、微波-超声辅助提取法和水酶法等。这些提取方法中,压榨法是较为常见的提取方法,其中低温冷榨法更具绿色、无污染、营养价值保留度高的优点\[4\]。水酶法作为安全环保的新兴油脂提取技术,符合当下低碳环保、绿色安全、环境友好的发展理念与趋势,具有显著的优势和潜力,目前水酶法提取油茶籽油已有工业化应用\[5\]。 本研究利用冷榨法和水酶法提取山核桃油,对比分析这两种提取方法对山核桃油总多酚、总黄酮、维生素E、角鲨烯、β-谷甾醇含量和脂肪酸组成及含量的影响,以期为山核桃油的绿色提取、合理利用和深加工等领域提供技术参考和理论基础。
     1材料与方法
     1.1实验材料
     1.1.1原料与试剂 山核桃,产自浙江省杭州市临安区,手工剥壳取仁,置于-60 ℃超低温冰箱,保存待用;木瓜蛋白酶(6 000 U/mg,最适反应温度50~60 ℃,最适pH 4.8~6.2),国药集团化学试剂有限公司;没食子酸(99%)、芦丁(97%)、维生素E(97%)、角鲨烯(98%)、β-谷甾醇(97%)标准品和脂肪酸甲酯混标,上海源叶生物科技有限公司;福林酚(BR),上海麦克林生化科技有限公司;碳酸钠、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钠、氢氧化钾、石油醚、无水硫酸镁、二氯甲烷、苯均为分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司;甲醇、乙腈均为色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司。
     1.1.2仪器与设备 BS200S-WE1电子天平;MJ-PB80 Easy 218搅拌机;DHG-9146 A电热恒温鼓风干燥箱;DD85G种子榨油机,德国KOMET公司;MDF-U32V(N)超低温冰箱;BCD-207 AK冰箱;RE-52AA旋转蒸发器;LXJ-HB飞鸽低速大容量离心机;循环水式多用真空泵;DK-8 B型电热恒温水浴锅;UV-1800紫外/可见分光光度仪、LC-2030C 3D Plus高效液相色谱仪,日本岛津株式会社;7890 B气相质谱联用仪,安捷伦科技有限公司。
     1.2实验方法
     1.2.1山核桃油的提取 将山核桃仁于40 ℃烘干至水分含量3%~5%,待提油。 冷榨法:设置榨油机温度100 ℃、转头D15、转速20 r/min榨取粗油,静置72 h后过滤除去残渣,放置于深色玻璃容器中并以锡纸包裹,4 ℃避光储藏,备用。 水酶法:参考钱浩杰等\[6\]的方法并进行了改良。山核桃仁经粉碎机粉碎,过0.3 mm(50目)筛,按料液比1∶ 5加入蒸馏水充分混匀,调节pH至62,放入505 ℃水浴锅中预热1 h,加入占山核桃原料质量0.20%的木瓜蛋白酶后,在50.5 ℃酶解150 min,于100 ℃煮沸灭酶10 min,以4 800 r/min离心30 min后分离料液,液体层和固体层分别用适量石油醚进行萃取,收集萃取液于40 ℃进行旋转蒸发回收石油醚,所得粗油置于深色玻璃容器,敞口于常温下放置24 h使石油醚充分挥发后以锡纸包裹,4 ℃避光储藏,备用。 以所得油脂质量占山核桃仁质量计算山核桃油得率。
     1.2.2总多酚和总黄酮含量测定 总多酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法。准确称取10 mg没食子酸标准品,加无水乙醇定容至100 mL配制成100 mg/L的标准溶液,吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的没食子酸标准溶液分别置于25 mL容量瓶中,加入25 mL Folin-Ciocalteu显色剂摇匀,避光后,加入5 mL 5%碳酸钠溶液,加无水乙醇定容,在40 ℃下放置30 min,在750 nm处测定其吸光值。以没食子酸质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到的曲线回归方程为Y=0.105 5X+0.004 5,相关系数(R2)为0.999 4。配制一定质量浓度的样品溶液,加入Folin-Ciocalteu显色剂,按上述方法测定吸光值,带入标准曲线回归方程中,计算总多酚含量,结果以没食子酸质量计。 总黄酮含量测定采用硝酸铝络合分光光度法。精密称取芦丁标准品20 mg,加入60%乙醇定容至200 mL配制成100 mg/L的标准溶液。分别吸取0、1、2、3、4、5、6 mL的芦丁标准溶液于25 mL容量瓶中,加入60%乙醇至6 mL,加入1 mL 5% NaNO2溶液摇匀,静置6 min,加入1 mL 10%Al(NO3)3溶液摇匀,静置6 min,加入10 mL 4%NaOH溶液摇匀,加入60%乙醇定容,放置15 min,在509 nm波长处测定其吸光值。以芦丁质量浓度(X)为横坐标,吸光值(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到的曲线回归方程为Y=11.022 3X+0.000 5,相关系数(R2)为0.999 4。配制一定质量浓度的样品溶液,加入NaNO2溶液,按上述方法测定吸光值,带入标准曲线方程中,计算总黄酮含量,结果以芦丁质量计。
     1.2.3维生素E、角鲨烯和β-谷甾醇含量测定 标准溶液的制备:分别精密称取维生素E、角鲨烯和β-谷甾醇标准品100 mg置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,配成质量浓度为2.0 mg/mL 的标准溶液。加入甲醇分别稀释为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL的质量浓度梯度。进高效液相色谱仪,在各自的HPLC条件下进行测定,绘制质量浓度(X)与峰面积(Y)关系曲线。得出在0~1.0 mg/mL范围内维生素E、角鲨烯与β-谷甾醇的含量分别与其峰面积呈良好线性关系,回归方程分别为Y=2 495 037.670 5X+22 694.311 4、Y=14 158 844.726 7X+4 973.559 1和Y=1 545 486.702 1X-9 411.714 3,相关系数(R2)分别为0.999 8、0999 7和0.999 8。 维生素E含量测定:称取山核桃油0.1 g(精确到0.1 mg),置于50 mL离心管中,加入适量甲醇,利用旋涡振荡器振荡3 min,加入甲醇定容,以4 000 r/min离心5 min,取上清液过0.22 μm有机微孔滤膜,进行HPLC测定\[7\]。将测定结果代入标准曲线回归方程中,计算山核桃油维生素E含量。HPLC条件:C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为甲醇,流速1.0 mL/min;PDA检测器;进样量10 μL;柱温30 ℃;检测波长290 nm。 角鲨烯含量测定:参考刘丽婉\[8\]的方法稍作修改。称取0.1 g山核桃油,置于250 mL烧杯中,加入50 mL 2 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液混匀,在70 ℃恒温水浴锅中皂化反应50 min,冷却至室温后,转移至500 mL分液漏斗,加入50 mL石油醚,振荡混匀3 min,静置分层,取上层石油醚相;再用50 mL石油醚分别萃取下层水相2次,合并所有的石油醚相,用超纯水洗涤石油醚相至中性,经无水硫酸镁脱水,于40 ℃旋转蒸发至近干,用1 mL乙腈溶解过0.22 μm有机微孔滤膜,进行HPLC测定。将测定结果代入标准曲线回归方程,计算山核桃油中角鲨烯含量。HPLC条件:C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为乙腈-甲醇(体积比60∶ 40),流速1.0 mL/min;PDA检测器;进样量10 μL;柱温30 ℃;检测波长210 nm。 β-谷甾醇含量测定:以邱丰艳等\[9\]的方法为基础稍加修改。精确称取山核桃油0.1 g置于容量瓶中,加入10 mL 2 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液,于70 ℃水浴加热皂化180 min,再加入10 mL饱和氯化钠溶液,将皂化液转移至500 mL分液漏斗,利用石油醚对皂化液提取3次,每次加石油醚50 mL,于4 000 r/min离心10 min。将上层的石油醚相合并,用超纯水洗至中性,经无水硫酸镁脱水过滤后,旋转蒸发将料液蒸干,得到的不皂化物按体积比1∶ 9加入二氯甲烷-甲醇溶液(体积比1∶ 1)溶解,转移至50 mL容量瓶定容,过0.22 μm有机微孔滤膜,进行HPLC测定。将测定结果代入标准曲线回归方程,计算山核桃油β-谷甾醇含量。HPLC条件:C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相为甲醇-水(体积比98.5∶ 1.5),流速1.0 mL/min;PDA检测器;进样量10 μL;柱温35 ℃;检测波长210 nm。
     1.2.4脂肪酸组成及含量测定 称取0.1 g(精确到0.1 mg)山核桃油,置于25 mL具塞试管,加入3 mL石油醚-苯(体积比1∶ 1)溶液,于40 ℃恒温水浴30 min,冷却后加入2 mL 04 mol/L氢氧化钾-乙醇溶液涡旋混合均匀,沿试管壁加入3.5 mL饱和氯化钠溶液,静置待分层,取上清液过0.22 μm有机微孔滤膜,进行GC-MS测定\[10\]。GC-MS条件:Agilent DB-FFAP型毛细管色谱柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm);柱流量0.5 mL/min;进样口温度250 ℃;载气为高纯氦气;升温程序为初始柱温80 ℃,保持1 min,以15 ℃/min升温到170 ℃,保持6 min,再以10 ℃/min升温到220 ℃,保持15 min;进样量1 μL;分流比20∶ 1;EI离子源,离子源温度230 ℃;电离电压70 eV;电子倍增电压980 V;质荷比范围50~550;扫描速率5次/s,全扫描模式。 利用保留时间结合NIST 2014标准质谱库检索进行定性,采用峰面积归一化法定量。
     1.2.5数据处理 每组实验重复3次,数据以“平均值±标准差”表示。采用SPSS(Version 25.0 for Windows,SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行方差分析(ANOVA),采用Tukey检验确定均值之间的显著性差异(P<005)。
     2结果与分析
     2.1提取方法对山核桃油得率的影响(见表1)

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注:同行数据右肩不同小写字母表示差异显著(P<005)。下同 由表1可看出,冷榨法的山核桃油得率显著高于水酶法的(P<0.05)。冷榨法工艺简单,出油快、效率高、损耗小,影响得率因素仅有物料水分和榨油温度\[11\];而水酶法工艺复杂,耗时长,可诱发失油因素多,如物料破碎度过高\[12\]、酶解温度不适\[13\]、酶解时间过长\[14\]等,本实验由于物料破碎度过高,致使其乳化现象严重,导致水酶法山核桃油得率显著低于冷榨法(P<0.05)。
     2.2提取方法对山核桃油中总多酚和总黄酮含量的影响 两种方法提取的山核桃油总多酚和总黄酮含量对比结果见表2。

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山核桃油中总多酚和总黄酮具有广泛的生物活性,可起到良好的保护心血管、抗衰老、抗肿瘤及抑菌等作用\[15-16\]。由表2可看出,冷榨法提取的山核桃油中总多酚和总黄酮含量均显著高于水酶法(P<0.05)。水酶法提油过程中总多酚和总黄酮可能受酸碱、酶解温度、酶解时间的影响而发生降解。
     2.3提取方法对山核桃油中维生素E、角鲨烯和β-谷甾醇含量的影响 两种方法提取的山核桃油中维生素E、角鲨烯与β-谷甾醇含量对比结果见表3。

表3两种方法提取的山核桃油中维生素E、角鲨烯
     和β-谷甾醇含量对比

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维生素E、角鲨烯和β-谷甾醇作为天然营养成分,是山核桃油中的微量脂质伴随物。维生素E具有抗氧化、抗癌、增强机体免疫力等功能,角鲨烯具有抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤等功能\[17\],β-谷甾醇具有降低胆固醇、预防癌症、防治心血管疾病功能\[18\]。这3种活性成分含量的高低受其自身在油脂中的溶解程度以及热耐受程度影响。由表3可看出,冷榨法山核桃油的维生素E含量显著高于水酶法山核桃油(P<0.05),而角鲨烯和β-谷甾醇含量显著低于水酶法山核桃油(P<0.05),这可能与水酶法对油料的破碎程度高更有利于活性成分的溶出有关。维生素E是评价油脂抗氧化性能的重要指标,冷榨法山核桃油中高维生素E含量可能更有利于其保质期的延长\[19\]。
     2.4提取方法对山核桃油中脂肪酸组成及含量的影响 图1为两种方法提取的山核桃油的脂肪酸GC-MS图,表4为两种方法提取的山核桃油的脂肪酸含量。

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 由表4可看出:冷榨法山核桃油共检出11种脂肪酸,以油酸含量最高,为56.32%,其次是亚油酸,含量为25.42%,不饱和脂肪酸总量为90.93%,而饱和脂肪酸总量为9.41%;水酶法山核桃油共检出8种脂肪酸,以油酸含量最高,达59.05%,其次是亚油酸,含量为26.00%,不饱和脂肪酸总量高达9409%,而饱和脂肪酸总量仅为5.74%。冷榨法山核桃油的脂肪酸种类多于水酶法,其中山嵛酸、木蜡酸、DHA未在水酶法山核桃油中检出,原因可能是水酶法提取油脂步骤多,因时间、温度和酶等各种因素造成流失。两种提取方法山核桃油中除亚麻酸含量之间无显著性差异(P>0.05)外,其他脂肪酸含量之间均有显著性差异(P<0.05)。 脂肪酸是油脂营养价值高低的重要评判依据,人体摄入饱和脂肪酸过高会导致血胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高,继发引起动脉管腔狭窄,形成动脉粥样硬化,增加患冠心病的风险\[20\];不饱和脂肪酸在降低胆固醇、预防和缓解心脑血管疾病、糖尿病和肥胖症方面具有重要功效,还能使血液的黏稠度减小,其中油酸和亚油酸是主要的功能因子\[21\]。冷榨法山核桃油的饱和脂肪酸以花生酸含量最高,其次为肉豆蔻酸,而水酶法山核桃油的饱和脂肪酸以棕榈酸含量最高,其次是肉豆蔻酸;两种山核桃油的不饱和脂肪酸均以油酸、亚油酸和亚麻酸为主。水酶法山核桃油的棕榈酸和棕榈油酸含量显著高于冷榨法的,可用于化学乳化剂、工业润滑剂等。冷榨法山核桃油的花生酸和肉豆蔻酸含量显著高于水酶法的,可适用于工业用洗涤剂、香料溶剂等。
     3结论 冷榨法山核桃油得率显著高于水酶法的,其总多酚、总黄酮、维生素E含量显著高于水酶法的,而角鲨烯和β-谷甾醇含量显著低于水酶法的。冷榨法山核桃油共检出11种脂肪酸,水酶法山核桃油共检出8种脂肪酸,未检出山嵛酸、木蜡酸、DHA,但两种方法提取的山核桃油中不饱和脂肪酸总量均达到90%以上。根据脂肪酸种类及含量的差异,两种方法提取的山核桃油可用于不同的用途。
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