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尿素包合法富集苦瓜籽油中α-桐酸的工艺优化

发布日期:2022-04-12 11:53来源:中国油脂作者:帅晓艳(lkmoo)点击次数:

苦瓜(Momordica charantia L,MC),是葫芦科(Cueurbitaeeae)苦瓜属草本植物果实,作为一种药食同源性瓜果,在我国已有上千年的栽培食用历史,其营养价值在所有葫芦科植物中排名第一\[1\],具有抗肿瘤、降低胆固醇等多种生物功效\[2\]。苦瓜籽仁中含有多糖、皂苷等生物活性成分,其蛋白质含量高达39%~45%\[3\]。苦瓜籽仁中含有大量油脂,占苦瓜籽总质量的25%以上\[4\]。苦瓜籽油富含共轭亚麻酸(CLN),尤其含有大量α-桐酸(CLN的一种)\[5\]。共轭亚麻酸是一组在C9,11,13位具有双键的十八碳三烯酸的同分异构体,其天然存在于极少数反刍动物体内和植物种子油中,且主要以甘油三酯的形式存在。近年来,许多研究表明共轭亚麻酸具有减肥\[6\]、抗癌\[7\]、抗糖尿病\[8\]和调节肝脂代谢\[9\]等多种生理功能。苦瓜籽油作为为数不多的富含α-桐酸的可食用植物油来源之一,具有良好的应用开发价值。当前,对苦瓜及苦瓜籽中生物活性物质的分离纯化研究多集中于活性多肽、多糖和皂苷等成分,而对功能性脂肪酸分离方面的研究报道较少。脂肪酸分离纯化方法主要包括蒸馏法、尿素包合法、低温结晶法、高速逆流色谱法、脂肪酶辅助法、超临界CO2萃取法、分子蒸馏法等 \[10\]。与其他方法相比,尿素包合法操作简单,试验条件温和,成本低且无污染。本试验以超临界CO2萃取的苦瓜籽油为原料,采用皂化酸解法制得混合脂肪酸,再利用尿素包合法对α-桐酸进行富集,分析富集前后的脂肪酸组成及含量,以期为苦瓜籽油的深度开发和综合利用研究提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料苦瓜籽油(超临界CO2萃取所得),运鸿集团股份有限公司提供;氢氧化钾、95%乙醇、石油醚(30~60 ℃)、盐酸、无水硫酸钠、尿素等,均为分析纯;甲醇、正己烷,均为色谱级,美国Fisher公司;α-桐酸标准溶液(5 mg/mL),上海甄准生物公司。PF-101T集热式恒温磁力搅拌器;R3旋转蒸发仪,瑞士 Buchi 公司;YR-PTB真空泵;AL204电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;PCR-B-SF-10 超纯水机;7890A-5975C气相色谱质谱联用仪,美国Agilent公司。

1.2试验方法

1.2.1苦瓜籽油理化指标测定相对密度,参照GB 5009.2—2016进行测定;酸值,参照GB 5009.229—2016进行测定;碘值,参照GB/T 5532—2008进行测定;过氧化值,参照GB 5009.227—2016进行测定;皂化值,参照GB/T 5534—2008进行测定。

1.2.2苦瓜籽油混合脂肪酸的制备准确称取4 g左右苦瓜籽油于烧瓶中,加入0.5 mol/L氢氧化钾乙醇溶液20 mL,于70 ℃下磁力搅拌回流1.5 h。冷却至室温,加入2 mL蒸馏水后用石油醚萃取3次,除去溶液中的不皂化物。底层溶液用2 mol/L HCl调节pH至2~3,用石油醚萃取3次后合并有机相,用无水硫酸钠脱水,旋转蒸发除去石油醚后得到苦瓜籽油混合脂肪酸。     

1.2.3尿素包合法富集α-桐酸参照文献\[11-12\],尿素中加入一定量溶剂(95%甲醇或95%乙醇),于75 ℃水浴下加热回流并磁力搅拌至尿素溶解完全,然后加入一定量苦瓜籽油混合脂肪酸,在70 ℃水浴下加热回流并磁力搅拌,直至溶液变为澄清透明后,室温下冷却,于一定温度下包合一定时间。包合完成后减压抽滤,滤液于40 ℃回收溶剂后加入2 mL蒸馏水并用2 mol/L HCl调节pH为2~3,加石油醚萃取3次,合并有机相后用温水洗至溶液呈中性,加入无水硫酸钠进行脱水,旋转蒸发回收石油醚,即得较高含量的α-桐酸(产物)。产物收率为富集后α-桐酸质量与混合脂肪酸质量的比值。

1.2.4脂肪酸组成的测定参照GB 5009.168—2016,采用三氟化硼法对样品进行甲酯化,然后采用GC-MS测定脂肪酸组成。GC条件:HP-88色谱柱(100 m× 0.25 mm×0.20 μm);载气为99.999%高纯氮气,恒流模式,柱流速1 mL/min;进样量1 μL,不分流进样;进样口温度250 ℃;升温程序为150 ℃保持0 min,以4 ℃/min升温至190 ℃,保持5 min,再以2 ℃/min升温至230 ℃,保持10 min。MS条件:离子化方式EI+,电子能量70 eV,接口温度250 ℃,离子源温度 200 ℃。质谱库为NIST11.L。采用峰面积归一化法对各脂肪酸进行定量。

1.2.5α-桐酸纯度的计算先将1 mL 5 mg/mL α-桐酸标准品甲酯化。准确吸取1 mL α-桐酸甲酯(α-桐酸质量浓度2.5 mg/mL)于1 mL容量瓶中,作为α-桐酸甲酯标准储备液。精密量取储备液0.4、0.2、01、0.05、0.02 mL于1 mL容量瓶中,用正己烷定容,制得系列标准工作溶液,经GC-MS测定后,以峰面积(X)为横坐标,α-桐酸质量浓度(Y)为纵坐标绘制标准曲线,得到α-桐酸的标准曲线方程为Y=1.24×10-8X+0.166 5(R2=0.995 3)。根据标准曲线方程以及样品甲酯化后经GC-MS测定获得的α-桐酸甲酯峰面积,按下式计算试样的α-桐酸纯度(Y0)。Y0=c×Vm×10-3×100%

(1)式中:c为代入标准曲线计算所得α-桐酸质量浓度,mg/mL;V为甲酯化稀释体积,mL;m为甲酯化苦瓜籽油质量,g。  

1.2.6数据分析试验数据采用“平均数±标准差”表示,采用Origin 9.0 作图。   

2结果与讨论

2.1苦瓜籽油的理化指标(见表1)

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由表1可以看出,苦瓜籽油过氧化值相对较高,这与文献\[13-14\]报道不一致,可能与苦瓜籽油放置时间、苦瓜种类、提取方法有关。另外,苦瓜籽油皂化值较低,可能是因为其含有较多的不皂化物。

 2.2单因素试验

2.2.1尿素包合溶剂种类对α-桐酸富集的影响在混合脂肪酸与尿素质量比1∶ 4、尿素与溶剂质量比1∶ 4、包合温度0 ℃、包合时间18 h条件下,考察溶剂(95%甲醇、95%乙醇)对α-桐酸富集效果的影响,结果如图1所示。

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由图1可以看出,95%甲醇、95%乙醇作为溶剂时,包合后得到的α-桐酸纯度和产物收率差别不大,考虑到95%甲醇作溶剂可能会形成甲酯,甲酯具有一定的毒性\[15\],影响α-桐酸后续在保健品等方面的应用。因此,选择95%乙醇作溶剂。

2.2.2尿素与溶剂质量比对α-桐酸富集的影响

在95%乙醇作溶剂、混合脂肪酸与尿素质量比1∶ 4、包合温度0 ℃、包合时间18 h条件下,考察尿素与乙醇质量比对α-桐酸富集效果的影响,结果如图2所示。由图2可以看出,α-桐酸纯度和产物收率随着乙醇用量的增加均有较大幅度的提高,α-桐酸纯度由29.67%提高到44.21%,产物收率由12.94%提高到26.92%。这是因为乙醇用量的增加会降低混合脂肪酸的浓度,尿素分子可以与脂肪酸充分接触,单不饱和脂肪酸更容易被尿素包合。此外,受乙醇用量增加的影响,混合脂肪酸的黏度逐渐降低,进一步减少了过滤过程中尿素包合晶体对多不饱和脂肪酸的吸附,从而使得滤液中α-桐酸的纯度提高。在尿素与乙醇质量比为1∶ 5时,尿素分子的包合能力即将达到极限,α-桐酸纯度和产物收率增加都趋于平缓。因此,选择尿素与乙醇质量比为1∶ 5。

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2.2.3混合脂肪酸与尿素质量比对α-桐酸富集的影响在95%乙醇作溶剂、尿素与乙醇质量比1∶ 5、包合温度0 ℃、包合时间18 h条件下,考察混合脂肪酸与尿素质量比对α-桐酸富集效果的影响,结果如图3所示。

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由图3可以看出:随着混合脂肪酸与尿素质量比的增加,α-桐酸的纯度逐渐提高,由35.60%提高到50.20%;而产物收率随混合脂肪酸与尿素质量比的增加从22.66%降低到12.15%。这可能是因为当尿素用量较低时,各脂肪酸之间会相互竞争,尿素无法将单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸完全包合,因此在滤液中残留较多未被包合的单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸,使得α-桐酸的纯度不高而产物收率较高。但是尿素包合脂肪酸的能力是一定的,尿素用量过多时,剩余的尿素就会与部分多不饱和脂肪酸进行包合,从而导致产物收率降低。此外,多不饱和脂肪酸和尿素分子均具有较强的极性,彼此之间存在相互吸附作用,并能形成氢键,在过滤过程中部分多不饱和脂肪酸仍能被尿素吸附。因此,选择混合脂肪酸与尿素质量比为1∶4。

2.2.4包合时间对α-桐酸富集的影响在95%乙醇作溶剂、尿素与乙醇质量比1∶ 5、混合脂肪酸与尿素质量比1∶ 4、包合温度0 ℃条件下,考察包合时间对α-桐酸富集效果的影响,结果如图4所示。

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由图4可以看出,随着包合时间的延长,α-桐酸纯度先增加后趋于平缓,同时产物收率随着包合时间的延长而减少。这可能是由于在较短的包合时间内,尿素晶粒生长受到影响,随着包合时间的延长,尿素与饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的包合更加充分,从而使得α-桐酸纯度逐渐提高。然而当尿素的晶粒长到一定限度时,继续包合会导致尿素对多不饱和脂肪酸的包合,从而降低产物收率。因此,选择包合时间为18 h。

2.2.5包合温度对α-桐酸富集的影响在95%乙醇作溶剂、尿素与乙醇质量比1∶ 5、混合脂肪酸与尿素质量比1∶ 4、包合时间18 h条件下,考察包合温度对α-桐酸富集效果的影响,结果如图5所示。

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由图5可以看出:随包合温度的升高,α-桐酸纯度呈下降趋势,这是因为尿素包合过程是一个放热的过程,较低的温度能够促进包合物生成,提高产物纯度\[16\];但是在包合温度过低时,尿素与脂肪酸包合速率过快,反应体系在未包合完全的情况下就已经凝结,使得后期过滤困难,导致产物收率偏低,随着包合温度的升高,多不饱和脂肪酸在乙醇中的溶解度提高,使产物收率升高。然而包合温度升高,脂肪酸与尿素的结合并不稳固,包合物晶体之间分布较为松散,饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸很容易与尿素脱离,从而使α-桐酸纯度下降。包合温度为0 ℃时,α-桐酸纯度和产物收率都较高。因此,选择包合温度为0 ℃。

2.3正交试验

在单因素试验基础上,固定95%乙醇作为尿素溶剂,尿素与乙醇质量比1∶ 5,以混合脂肪酸与尿素质量比、包合时间、包合温度为因素,α-桐酸纯度为指标,设计三因素三水平的正交试验优化α-桐酸富集工艺。正交试验因素水平见表2,正交试验设计及结果见表3。

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由表3可以看出,各因素对α-桐酸富集的影响主次顺序为A>C>B,即混合脂肪酸与尿素质量比的影响最大,其次是包合温度、包合时间。最佳工艺组合为A1B3C3,即选择95%乙醇为尿素溶剂,尿素与乙醇质量比1∶ 5,混合脂肪酸与尿素质量比1∶ 3,包合温度4 ℃,包合时间24 h。在最佳条件下,α-桐酸纯度为60.03%,产物收率为33.94%。

2.4尿素包合前后脂肪酸组成(见表4)

由表4可知:苦瓜籽油中共检出8种脂肪酸,与张飞等\[14\]的研究结果相似;饱和脂肪酸有3种,不饱和脂肪酸有5种,其中共轭亚麻酸包括α-桐酸及其两种顺反异构体CLN-B、CLN-C,与文献\[14,17-18\]所测的苦瓜籽油含有高不饱和脂肪酸结果相同。富集前苦瓜籽油中主要的脂肪酸是硬脂酸和α-桐酸,相对含量分别为37.64%、32.97%,富集后,硬脂酸相对含量减少至16.10%,而α-桐酸相对含量增加至53.94%,此时α-桐酸纯度为60.03%,较苦瓜籽油中的28.83%显著提高;共轭亚麻酸相对含量达到71.28%,比富集前增加了1965百分点。因此,尿素包合法可用于富集苦瓜籽油中的α-桐酸。

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3结论

以超临界CO2萃取的苦瓜籽油为原料,采用尿素包合法富集苦瓜籽油中的α-桐酸。通过单因素试验和正交试验,确定最佳富集工艺条件为:以95%乙醇为尿素溶剂,苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素质量比1∶ 3,尿素与乙醇质量比1∶ 5,包合温度4 ℃,包合时间24 h。在最佳条件下,α-桐酸纯度为6003%,产物收率为33.94%,α-桐酸相对含量为53.94%,共轭亚麻酸相对含量达到71.28%。
     

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